探討流體剪切力對細(xì)胞活動的影響--流體剪切力對細(xì)胞吸收人造細(xì)胞器的影響

      丹麥奧胡斯大學(xué)的納米科學(xué)近日在SMALL雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于納米材料作為有細(xì)胞活性人造細(xì)胞器的文章。文章介紹了個(gè)有趣的現(xiàn)象：細(xì)胞在剪切力條件下培養(yǎng)的時(shí)候，會吸收更多的納米顆粒，并且沒有附加的細(xì)胞毒性。
    文章中采用了內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞做為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)在ibidi通道載玻片中，之后使用含有納米顆粒的培養(yǎng)基，以一定的剪切力刺激細(xì)胞，細(xì)胞吸收的納米顆粒的量比靜置狀態(tài)下有顯著的升高。
        分享一下這個(gè)實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)，或許大家可以從中找到自己研究領(lǐng)域的靈感。

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
1.細(xì)胞： 內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞
2.納米顆粒：pPDA：在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚多巴胺（dopamine）
             pPEG：在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚乙二醇（ethylene glycol）
             pRGD：在800nm直徑的二氧化硅表面包被L-精氨酸、甘氨酸和L-天門冬氨酸的多聚物（Arginylglycylaspartic acid ( RGD ) is a tripeptide composed of L -arginine , glycine , and L -aspartic acid）
3.培養(yǎng)耗材：ibidi六通道載玻片μ-Slide VI0.4 Luer （ibidi，Germany，80606）
             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
             串聯(lián)管（ibidi，Germany，10830）
             封口夾 
1.儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

二.實(shí)驗(yàn)方法
在實(shí)驗(yàn)開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置第二天，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

一）培養(yǎng)細(xì)胞
準(zhǔn)備內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。好使用比較健康的內(nèi)皮細(xì)胞，以防在做流體實(shí)驗(yàn)時(shí)候細(xì)胞不能穩(wěn)定貼壁。

按照下面流程鋪細(xì)胞：
1.按每通道10000個(gè)巨噬細(xì)胞和40000個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞將細(xì)胞鋪于通道載玻片的中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個(gè)通道。
2.蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個(gè)注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基。
3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)2-4小時(shí)左右，等到細(xì)胞剛剛長滿為單細(xì)胞層，即可開始實(shí)驗(yàn)。注意，要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，使每個(gè)細(xì)胞均受到均勻的剪切力。

二.搭建流體系統(tǒng)
1.將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入含納米顆粒的7.5ml培養(yǎng)基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會影響剪切力的大小，有時(shí)還會使灌流系統(tǒng)中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）
  

2.連接通道載玻片。使用串聯(lián)管，將通道串聯(lián)起來。這樣可以在同一個(gè)條件，同一種液體的刺激下培養(yǎng)不同的樣本。

在細(xì)胞貼壁后，將串聯(lián)管如如圖示插入串聯(lián)管

在每一個(gè)注液孔中加滿培養(yǎng)基，要注意不能把氣泡加入在注液孔中。

用1ml的無菌注射器吸滿培養(yǎng)基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。

小心推入培養(yǎng)基，直到*個(gè)串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出。

小心的將串聯(lián)管彎過來，插入相鄰的注液孔中。不要產(chǎn)生氣泡。

繼續(xù)推動注射器，直到第二根串聯(lián)管也被充滿，繼續(xù)推動注射器充滿下一根串聯(lián)管。

重復(fù)上面的操作，繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。

將所有的串聯(lián)管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用封口夾夾住。

小心將灌流管的一個(gè)魯爾接頭從聯(lián)通管中拔出，插入后一個(gè)注液孔中。

小心將注射器移除，在注液孔中加滿培養(yǎng)基，將灌流管的另一個(gè)接頭插入。

串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。

三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖所示，對于內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在剪切力為г4=4 dyn/cm2時(shí)比靜置條件г0吸收pRGD這種納米材料有非常顯著的升高。